Giải Trình Tự Sanger, còn được biết đến là phương pháp chấm dứt chuỗi dideoxy, là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định trình tự chính xác của nucleotide trong một phân tử DNA. Được phát minh bởi nhà hóa sinh người Anh Frederick Sanger vào năm 1977, phương pháp này đã cách mạng hóa lĩnh vực sinh học phân tử và mở ra cánh cửa cho vô số tiến bộ trong y học, di truyền học và công nghệ sinh học.
Cơ chế hoạt động của Giải trình tự Sanger
Giải trình tự Sanger dựa trên việc sử dụng các nucleotide đã được biến đổi đặc biệt, được gọi là dideoxynucleotide (ddNTPs), cùng với các nucleotide thông thường (dNTPs) trong phản ứng tổng hợp DNA in vitro.
Không giống như dNTPs, ddNTPs thiếu một nhóm hydroxyl (-OH) ở vị trí 3′ của phân tử đường deoxyribose. Do đó, khi một ddNTP được kết hợp vào chuỗi DNA đang tổng hợp, nó sẽ ngăn chặn sự gắn kết của nucleotide tiếp theo. Kết quả là chuỗi DNA bị chấm dứt tại vị trí mà ddNTP được kết hợp.
Các bước thực hiện Giải trình tự Sanger
Giải trình tự Sanger được thực hiện thông qua một loạt các bước sau:
- Tách chiết và khuếch đại DNA: Đầu tiên, phân tử DNA cần được giải trình tự được tách chiết và khuếch đại sử dụng kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase).
- Phản ứng tổng hợp DNA: DNA được khuếch đại sau đó được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng tổng hợp DNA in vitro. Phản ứng này bao gồm DNA polymerase, mồi (primer), dNTPs và một lượng nhỏ ddNTPs được đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang.
Phản ứng tổng hợp DNA trong giải trình tự Sanger
- Điện di: Các đoạn DNA được tổng hợp sau đó được phân tách theo kích thước bằng điện di trên gel polyacrylamide.
- Đọc trình tự: Vị trí của các đoạn DNA được đánh dấu trên gel được phát hiện bằng cách chụp ảnh phóng xạ hoặc huỳnh quang. Trình tự DNA của đoạn DNA ban đầu được xác định bằng cách đọc trình tự của các ddNTPs được kết hợp vào các đoạn DNA khác nhau.
Ưu điểm và hạn chế của Giải trình tự Sanger
Ưu điểm:
- Độ chính xác cao: Giải trình tự Sanger được biết đến với độ chính xác cao, với tỷ lệ lỗi thấp hơn 1/1000 nucleotide.
- Chi phí thấp: So với các phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS), giải trình tự Sanger có chi phí thấp hơn đáng kể, đặc biệt là đối với các dự án giải trình tự quy mô nhỏ.
- Dễ dàng thực hiện: Giải trình tự Sanger là một kỹ thuật tương đối đơn giản và dễ dàng thực hiện.
Hạn chế:
- Thông lượng thấp: So với NGS, giải trình tự Sanger có thông lượng thấp hơn, nghĩa là nó chỉ có thể giải trình tự một số lượng hạn chế các đoạn DNA cùng một lúc.
- Độ dài đọc ngắn: Giải trình tự Sanger chỉ có thể đọc được các đoạn DNA có độ dài tối đa khoảng 800-1000 nucleotide.
Ứng dụng của Giải trình tự Sanger
Mặc dù đã có sự phát triển của NGS, giải trình tự Sanger vẫn là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử và có nhiều ứng dụng, bao gồm:
- Xác định trình tự DNA: Giải trình tự Sanger được sử dụng rộng rãi để xác định trình tự của các đoạn DNA cụ thể, chẳng hạn như gen, plasmid và đoạn DNA được khuếch đại bằng PCR.
- Phát hiện đột biến: Giải trình tự Sanger có thể được sử dụng để phát hiện các đột biến trong DNA, chẳng hạn như đột biến điểm, chèn và xóa.
- Phân tích đa hình: Giải trình tự Sanger được sử dụng để phân tích đa hình di truyền, chẳng hạn như SNP (đa hình nucleotide đơn) và STR (lặp lại song song ngắn).
Ứng dụng của giải trình tự Sanger
- Phân tích phát sinh loài: Giải trình tự Sanger được sử dụng để xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài khác nhau bằng cách so sánh trình tự DNA của chúng.
Kết luận
Giải trình tự Sanger là một kỹ thuật mạnh mẽ và linh hoạt đã cách mạng hóa lĩnh vực sinh học phân tử. Mặc dù có những hạn chế về thông lượng và độ dài đọc, giải trình tự Sanger vẫn là một công cụ quan trọng cho nhiều ứng dụng nghiên cứu và chẩn đoán. Sự phát triển của giải trình tự Sanger đã mở đường cho sự ra đời của NGS, nhưng nó vẫn là một kỹ thuật có giá trị và tiếp tục được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng.